A clonagem molecular é um tipo de trabalho em biologia molecular. É usada para montar moléculas de DNA recombinantes, e para direcionar sua replicação dentro dos organismos hospedeiros. O uso da palavra clonagem significa que uma molécula de DNA de uma única célula viva é usada para fazer uma grande população de células contendo moléculas de DNA idênticas. Os métodos de clonagem molecular são centrais para muitas áreas da biologia e medicina modernas.
A clonagem molecular geralmente utiliza seqüências de DNA de dois organismos diferentes: a espécie que é a fonte do DNA a ser clonado, e a espécie que servirá como hospedeiro vivo para multiplicar (replicar) o DNA recombinante.
Em um experimento de clonagem molecular, o DNA a ser clonado é obtido de um organismo de interesse e depois tratado com enzimas no tubo de ensaio para obter fragmentos menores de DNA. Estes fragmentos são então unidos com DNA vetorial para produzir moléculas de DNA recombinantes. O DNA recombinante é então introduzido em um organismo hospedeiro (tipicamente uma cepa de E. coli de laboratório, benigna e fácil de cultivar). Isto produz uma população de organismos nos quais moléculas de DNA recombinante são replicadas junto com o DNA hospedeiro. Como elas contêm fragmentos de DNA estranho, são microorganismos "transgênicos" ou geneticamente modificados (GMO).
Este processo aproveita o fato de que uma única célula bacteriana pode ser induzida a absorver e replicar uma única molécula de DNA recombinante. Esta única célula pode então ser expandida exponencialmente para gerar uma grande quantidade de bactérias, cada uma delas contendo cópias da molécula recombinante original. Assim, tanto a população bacteriana resultante, quanto a molécula de DNA recombinante, são comumente chamadas de "clones". Estritamente falando, DNA recombinante refere-se a moléculas de DNA, enquanto a clonagem molecular se refere aos métodos experimentais usados para montá-las.