O jogo começa com o Chell acordando em um pequeno quarto de vidro que tem apenas uma cama, um banheiro e um rádio dentro. Ela é informada pelo GLaDOS que os testes começarão em breve, e um portal laranja se abre em uma das paredes. Uma vez que o jogador passa, ela entra nas salas de teste e começa a testar. Há 20 salas de teste, chamadas Câmaras de teste, ao todo.
Os testes começam de forma simples. O Chell tem que pegar as caixas, chamadas de Cubos de Armazenamento Pesados (Cubos para encurtar), e colocá-las em botões, que abrirão a porta para a saída da câmara. Neste ponto, GLaDOS fala com Chell como um guia, elogia-a e promete seu bolo quando os testes terminarem. Perto do início do jogo, Chell recebe o Dispositivo de Portal Portátil Aperture Science, também conhecido como Portal Gun. A princípio, seu Portal Gun só faz portais azuis e os portais alaranjados são feitos por GLaDOS. Mais tarde, Chell recebe o Portal Gun completo e pode fazer tanto portais azuis quanto alaranjados.
Os testes se tornam cada vez mais perigosos mais longe no jogo. Em algumas salas, há veneno no chão. Em outras, há bolas de eletricidade chamadas High Energy Pellets, que matarão Chell se ela tocar nelas. Durante estes testes, o GLaDOS se torna cada vez mais sarcástico, dando conselhos inúteis ao Chell, tais como "O chão aqui vai matar você". Tente evitá-lo". A certa altura, o GLaDOS diz a Chell que uma câmara está quebrada e ela deve passar por uma câmara cheia de armas de sentinela, chamada Turrets. Se uma torre vê Chell, ela dispara contra ela até ela morrer. Nesta câmara há uma sala escondida. Na sala escondida há desenhos e escritos nas paredes deixados por uma pessoa desconhecida. A escrita diz coisas como "o bolo é uma mentira" e "ela está sempre observando" com uma foto de uma câmera. Há mais salas como esta em câmaras posteriores.
Em outra câmara, Chell tem que usar o Cubo de Companheiro Ponderado, que parece um Cubo de Armazenamento Ponderado com corações nele, para resolver o teste. Durante o teste, GLaDOS diz várias vezes a Chell que o Cubo Companheiro não está vivo, mas no final do teste, ela diz a Chell que tem que "matar" o Cubo Companheiro para chegar ao próximo teste.
Durante o último teste, a Chell tem que ficar em uma plataforma em movimento. No final da pista da plataforma, ele a carregará para um poço de incêndio. O GLaDOS agradece à Chell por fazer os testes. No último minuto, Chell usa sua Pistola Portal para escapar da armadilha. Enquanto tenta escapar do prédio, Chell é levada para uma sala onde encontra o GLaDOS. Chell quebra uma bola branca que caiu do GLaDOS. O GLaDOS lhe diz que ela foi estúpida em quebrá-la porque eles não sabiam o que era, mas o GLaDOS rapidamente descobre que era seu núcleo de moralidade. Ela diz à Chell que as pessoas que trabalhavam para a Aperture Science instalaram-na para fazê-la parar de matá-los com "Neuro-Toxina Mortífera". Como a Chell a quebrou, o GLaDOS pode usar a Neuro-Toxina novamente. Chell tem um limite de tempo de 6 minutos para matar o GLaDOS antes que a Neuro-Toxina mate Chell. Depois de quebrar pedaços dela e queimá-los, o GLaDOS é destruído e Chell escapa do prédio.
Após a fuga de Chell, ela desmaia e um robô a arrasta de volta para o prédio. Durante os créditos, GLaDOS canta uma canção chamada "Still Alive", escrita por Jonathan Coulton, que diz que mesmo que Chell a tenha matado, ela ainda está viva.
