Evolução direcionada
A evolução dirigida (DE) é um método usado para produzir enzimas para fins industriais ou médicos.
O método é a engenharia de proteínas que imita a seleção natural.
A idéia básica é colocar um gene através de repetidas rodadas de mutação, para fazer uma biblioteca de variantes. A seleção isola os genes com a função desejada. Eles são um modelo para a próxima rodada.
Isto pode ser feito in vivo (em células vivas de bactérias ou leveduras), ou in vitro (livre em solução ou microgotas).
O teste de mais mutantes aumenta as chances de encontrar um com as propriedades desejadas.
Durante a evolução in vivo, cada célula (geralmente bactérias ou leveduras) é transformada com um plasmídeo contendo um membro diferente da biblioteca de variantes. Apenas o gene de interesse difere entre as células, sendo que todos os outros genes são mantidos iguais.
As células expressam a proteína seja em seu citoplasma ou superfície onde sua função pode ser testada. Este formato tem a vantagem de selecionar propriedades em um ambiente celular, o que é útil quando a proteína evoluída ou RNA é para ser usada em organismos vivos.
Quando feito sem células, DE usa a tradução de transcrição in vitro para produzir proteínas ou RNA livre em solução ou dentro de microgotas artificiais. Isto tem a vantagem de permitir mais condições (por exemplo, temperatura, solventes). Ele pode expressar proteínas que seriam tóxicas para as células. Além disso, experimentos de evolução in vitro podem gerar bibliotecas muito maiores (até 1015) porque o DNA da biblioteca não precisa ser inserido nas células. Isso muitas vezes limita o que pode ser feito.
Um exemplo de evolução dirigida com comparação com a evolução natural. O ciclo interno mostra os três estágios do ciclo de evolução direcionada com o processo natural imitado entre parênteses. O círculo externo mostra as etapas de uma experiência típica. Os símbolos vermelhos indicam variantes funcionais, os símbolos pálidos indicam variantes com função reduzida.
Garantia de hereditariedade
Quando as proteínas funcionais tiverem sido isoladas, é necessário que seus genes também o sejam, portanto é necessário um vínculo genótipo-fenótipo.
Isto pode ser covalente, onde o gene mRNA está ligado à proteína no final da tradução pela puromicina.
Alternativamente, a proteína e seu gene podem ser mantidos juntos, ou em gotículas de emulsão. As seqüências gênicas isoladas são então multiplicadas por PCR ou por bactérias hospedeiras transformadas. Tanto a melhor seqüência única, ou um conjunto de seqüências pode ser usado como modelo para a próxima rodada de mutagênese. Os ciclos repetidos de diversificação - seleção-amplificação fazem com que as variações enzimáticas se adaptem ao processo de seleção.
Uma proteína expressa pode ser ligada covalentemente a seu gene (como no mRNA), à esquerda, ou colocada no mesmo compartimento com ela, à direita. De qualquer forma, o gene que codifica a proteína é isolado.
Prêmio concedido
O engenheiro americano Frances Arnold ganhou o Prêmio Millennium Technology por sua evolução pioneira dirigida.
Perguntas e Respostas
P: O que é evolução dirigida?
R: A evolução dirigida (DE) é um método usado para produzir enzimas para fins industriais ou médicos. É uma forma de engenharia de proteínas que imita a seleção natural.
P: Como funciona a evolução direcionada?
R: A evolução dirigida funciona colocando um gene através de repetidas rodadas de mutação, criando uma biblioteca de variantes. A seleção então isola genes com a função desejada, que depois são usados como modelos para a próxima rodada.
P: Onde pode ser feita a evolução dirigida?
R: A evolução dirigida pode ser feita in vivo (em células vivas de bactérias ou leveduras), ou in vitro (livre em solução ou microgotas).
P: Quais são as vantagens de se fazer a evolução dirigida in vivo?
R: Fazer evolução dirigida in vivo tem a vantagem de selecionar propriedades em um ambiente celular, o que é útil quando a proteína ou RNA evoluído é para ser usado em organismos vivos.
P: Quais são as vantagens de se fazer evolução direcionada in vitro?
R: Fazer evolução dirigida in vitro tem a vantagem de permitir mais condições (por exemplo, temperatura, solventes) e pode expressar proteínas que seriam tóxicas para as células. Além disso, pode gerar bibliotecas muito maiores, porque o DNA não precisa ser inserido nas células.
P: Quais são os limites do que pode ser feito durante uma experiência in vitro?
R: O tamanho limite do que pode ser feito durante um experimento in vitro é muitas vezes determinado pela quantidade de DNA que precisa ser inserida nas células.
