Uma enzima de restrição é uma enzima que corta o DNA em determinados lugares. Ela funciona em seqüências de nucleotídeos de reconhecimento específico ou próximo a elas, conhecidos como "locais de restrição". Para cortar o DNA, todas as enzimas de restrição fazem duas incisões, uma através de cada filamento da dupla hélice do DNA.

Estas enzimas são encontradas em bactérias e arcaias e as defendem contra vírus invasores, que são bacteriófagos.

Dentro de um prokaryote, as enzimas de restrição cortam seletivamente o DNA estranho em um processo chamado restrição. O DNA hospedeiro é protegido por outra enzima que protege o DNA hospedeiro e bloqueia a clivagem. Juntos, estes dois processos são o sistema de modificação de restrição. É o sistema imunológico mais antigo e mais simples. Eles também são uma espécie de elemento genético egoísta e móvel.

Mais de 3000 enzimas de restrição foram estudadas em detalhes, e mais de 600 delas estão disponíveis comercialmente. Estas enzimas são usadas rotineiramente para modificação de DNA em laboratórios, e são uma ferramenta vital na clonagem molecular.