Constantino tinha convidado todos os 1800 bispos da igreja cristã (cerca de 1000 no leste e 800 no oeste), mas apenas 250 a 320 bispos participaram de fato. Eusébio de Cesaréia contou 250, Athanasius de Alexandria contou 318, e Eustathius de Antioquia contou 270 (todos os três estavam presentes no conselho). Mais tarde, Sócrates Scholasticus registrou mais de 300, e Evagrius, Hilarius, Jerônimo e Rufinus registrou 318.
Os bispos receberam viagem gratuita para o conselho, bem como hospedagem. Estes bispos não viajaram sozinhos; cada um tinha permissão para trazer consigo dois sacerdotes e três diáconos; assim, o número total de participantes teria sido superior a 1500. Eusébio fala de um número quase inumerável de sacerdotes, diáconos e acólitos acompanhantes.
Um destaque especial também foi atribuído a este conselho porque a perseguição aos cristãos tinha acabado de terminar com o Édito de Milão de 313 de fevereiro pelos imperadores Constantino e Licinius.
Os bispos orientais formaram a grande maioria. Destes, o primeiro lugar foi ocupado pelos três patriarcas: Alexandre de Alexandria, Eustathius de Antioquia, e Macário de Jerusalém. As províncias de língua latina enviaram pelo menos cinco representantes: Marcus da Calábria da Itália, Ceciliano de Cartago da África, Hosius de Córdoba da Hispânia, Nicasius de Dijon da Gália e Domnus de Stridon da província do Danúbio. O Papa Silvester não compareceu, dizendo que estava doente, mas foi representado por dois sacerdotes.
Athanasius de Alexandria, um jovem diácono e companheiro do bispo Alexander de Alexandria, estava entre os assistentes. Atanásio acabou passando a maior parte de sua vida lutando contra o arianismo. Alexandre de Constantinopla, então um presbítero, também estava presente como representante de seu bispo idoso.