Em 539 a.C., o Império Neo-Babilônico caiu para Ciro o Grande, o rei da
Pérsia, na Batalha de Opis. As paredes da Babilônia eram muito altas e muito grossas. A única maneira de entrar na cidade era através de um de seus muitos portões. O Eufrates correu ao lado das muralhas e Ciro decidiu usar o rio para entrar na cidade. As tropas de Ciro desviaram o rio Eufrates. Isto fez com que o nível do rio descesse, permitindo a entrada de soldados na cidade.
Os babilônios haviam realizado uma celebração naquela noite. O exército persa tomou a maior parte da cidade antes que os babilônios se dessem conta de que os persas haviam entrado na cidade. O relato foi relatado por Heródoto, e também é mencionado na Bíblia hebraica. Ciro reivindicou a cidade andando pelas portas da Babilônia com pouca ou nenhuma resistência dos babilônios babilônicos bêbados.
Mais tarde, Cyrus emitiu um decreto permitindo que as pessoas, incluindo os judeus, retornassem a suas próprias terras. Isto é mencionado no Antigo Testamento. Ele permitiu que o templo dos judeus fosse reconstruído em Jerusalém.
Sob Ciro e o posterior rei persa Dario, o Grande, a Babilônia tornou-se a capital do 9º Satrapy (Babilônia no sul e Athura no norte). Era um centro de aprendizado e de avanço científico. Na Pérsia Aquemenida, as artes astronômicas e matemáticas da Babilônia foram revitalizadas. Os estudiosos da Babilônia fizeram mapas de constelações. A cidade era a capital administrativa do Império Persa. Este império era o mais poderoso do mundo então conhecido. Muitas descobertas arqueológicas importantes foram feitas que melhoraram nossa compreensão dessa época.
Os primeiros reis persas haviam tentado manter as cerimônias religiosas de Marduk. Pelo reinado de Dario III, o excesso de tributação e numerosas guerras haviam levado a uma deterioração dos principais santuários e canais da Babilônia, e à desintegração da região. Apesar de três rebeliões em 522 a.C., 521 a.C. e 482 a.C., a terra e a cidade da Babilônia permaneceram sob o domínio persa por dois séculos. Em 331 a.C., Alexandre o Grande tomou posse. Sob o Império Parthian, a Babilônia continuou a encolher e a perder importância.