Em 1606, a Smith foi contratada pela Virginia Company para estabelecer-se na Virginia Colony com fins lucrativos. Eles zarparam em três navios, em dezembro de 1606. Smith tinha um servo chamado Samuel Collier. Samuel Collier ficaria ao seu lado durante a maior parte do caminho.
Houve problemas durante a viagem e Smith foi acusado de motim. O Capitão Newport planejava executá-lo. O Capitão abriu uma carta de ordens da Companhia Virginia que dizia que Smith seria um dos líderes da nova colônia, portanto Smith não foi morto.
Os ingleses chegaram em abril de 1607 e o Capitão Wingfield escolheu Jamestown para ser o local para a colônia. No verão, os colonos ainda viviam em moradias temporárias. Após os quatro meses de viagem oceânica, os suprimentos alimentares eram apenas suficientes para que cada pessoa tivesse uma xícara ou duas de farinha de cereais por dia. Devido ao clima e à falta de alimentos espalhados pelo povo e em setembro, mais da metade morreu.
Em dezembro de 1607, Smith estava à procura de alimentos e foi capturado por índios americanos. Ele foi levado para conhecer o chefe da tribo Powhatan. A aldeia ficava a cerca de 15 milhas de Jamestown. Smith foi libertado sem danos e deu crédito em parte à filha do chefe, Pocahontas, que se jogou sobre seu corpo. Vendo isto, seu pai teve misericórdia de Smith e ele foi levado de volta a Jamestown em segurança. Este encontro iniciou uma relação de amizade entre os nativos, Smith e os colonos de Jamestown. No início de janeiro de 1608, quase 100 novos colonos chegaram com o Capitão Newport, e por descuido a vila foi incendiada. Naquele inverno, o rio James congelou e os colonos foram forçados a viver nas ruínas. Durante este tempo, Newport e sua tripulação perderam muito tempo carregando seus navios com pirita de ferro (ouro dos tolos). O suprimento de alimentos estava baixo e, embora os nativos americanos trouxessem alguma comida, Smith escreveu que "mais da metade de nós morreu".
Em abril de 1608, um navio trouxe suprimentos e 50 novos colonos, que a Smith se propôs a construir moradias e a plantar culturas.
No verão de 1608, Smith deixou Jamestown para explorar a região de Chesapeake Bay e procurar alimentos muito necessários. Ele fez um mapa que seria de grande valor para os exploradores da Virgínia por mais de um século. Em sua ausência, Smith deixou seu amigo Matthew Scrivener, como governador, em seu lugar. Scrivener se afogaria mais tarde em uma tempestade em uma viagem infeliz à Ilha Hog. Smith foi eleito presidente do conselho local em setembro de 1608 e instituiu regras rigorosas.
Em outubro de 1608, chegou um navio com 70 novos colonos, incluindo as primeiras mulheres. Alguns artesãos alemães e poloneses também chegaram, mas não trouxeram nenhum suprimento de alimentos. Depois disso, Smith tentou conseguir comida dos índios americanos e foram necessárias ameaças de força militar para que eles obedecessem. Powhatan se assustou com o grande número de homens brancos que vinham para a região e tentava matá-los de fome.
Smith descobriu que havia entre os colonos e nativos americanos que não gostavam de suas regras e planejavam matá-lo. Smith escreveu que ele foi avisado por Pocahontas. Ele convocou uma reunião e disse aos homens que não trabalhavam que "aquele que não vai trabalhar não vai comer...". Depois disso, a situação melhorou.
Durante três meses no início de 1609, fevereiro, março e abril tudo esteve bem em Jamestown, com muitas moradias construídas, acres de terra desmatada e muito mais trabalho feito. Em abril, os ratos e a umidade destruíram todo o milho armazenado. Eles precisavam muito de comida e Smith enviou um grande grupo de colonos para pescar e outros para colher mariscos nos rios. Eles voltaram sem comida e estavam dispostos a aceitar as parcas rações que lhes eram oferecidas. Isso irritou Smith e ele ordenou que trocassem suas armas e ferramentas por frutas dos índios e ordenou que todos trabalhassem ou teriam que deixar a segurança do forte. Alguns foram embora e foram para as aldeias indígenas americanas, mas o povo de Powhatan também seguiu a lei de Smith de que quem não trabalha, não come. Isto esteve em vigor até que eles ficaram quase famintos e voltaram para casa.
Em algum momento, chegou um navio inesperado, capitaneado por Samuel Argall. Ele tinha comida e vinho que Smith comprou com a promessa de pagar de volta. Argall também trouxe notícias de que a Companhia Virgínia estava enviando mais suprimentos e colonos para Jamestown junto com um novo governador, Lord De la Warr.
Em uma viagem à Virgínia em maio de 1609, Sir Thomas Smith, tesoureiro da Virginia Company, providenciou para que cerca de 500 colonos, incluindo mulheres e crianças, viessem. Uma frota de nove navios zarpou. Um deles afundou em uma tempestade logo após deixar o porto. O Sea Venture naufragou nas Ilhas Bermudas com o almirante e Stephen Hopkins a bordo. Um ano depois, em maio de 1610, eles tinham chegado a Jamestown em pequenos barcos que tinham feito. Gates logo descobriu que não havia comida suficiente para sustentar todos na colônia e decidiu abandonar Jamestown. Quando seus barcos estavam saindo da área de Jamestown, eles encontraram um navio carregando o novo governador, Lord De la Warr, que os mandou de volta para Jamestown.
Em agosto de 1609 John Smith ficou bastante surpreso ao ver a chegada de mais de 300 novos colonos. Londres estava enviando novos colonos sem nenhum planejamento sobre como ou onde eles iriam viver.
O Capitão John Smith foi gravemente ferido por uma explosão acidental de pólvora em sua canoa. Smith navegou para a Inglaterra para tratamento em outubro de 1609. Ele havia passado dois anos e meio tentando fazer o seu melhor por Jamestown. Ele nunca mais voltou à Virgínia. A história tem confirmado sua grande contribuição em Jamestown em seus primeiros anos.
Os colonos continuariam a morrer de várias doenças e enfermidades, com uma estimativa de 150 dos 500 sobreviventes naquele inverno. Apesar disso, a Companhia Virgínia continuou a financiar e transportar colonos para sustentar Jamestown. Nos cinco anos seguintes, os Governadores Gates e Sir Thomas Dale continuaram a manter uma disciplina rigorosa, com Sir Thomas Smith em Londres tentando encontrar artesãos qualificados e outros colonos para enviar a Jamestown.
