Cromatografia gasosa - espectrometria de massa

História

Os primeiros trabalhos de pesquisa sobre cromatografia gaso-líquida foram publicados em 1950. Os químicos usaram diferentes detectores para ver que os compostos estavam fluindo para fora do final do cromatógrafo. A maioria dos detectores destruía os compostos, porque os queimavam ou os ionizavam. Estes detectores deixaram os químicos adivinhando a identidade exata de cada composto na amostra. Nos anos 50, Roland Gohlke e Fred McLafferty desenvolveram uma nova máquina combinada. Eles usaram um espectrômetro de massa como detector em cromatografia de gás. Estes primeiros dispositivos eram grandes, frágeis e originalmente limitados a configurações de laboratório.

O projeto era complexo. O intervalo de tempo entre os diferentes compostos que saíam do cromatógrafo era difícil de controlar. Portanto, o espectrômetro de massa tinha que terminar de trabalhar em um composto antes que o próximo fluísse para fora do cromatógrafo. Nos primeiros modelos, as medidas do espectrômetro de massa eram registradas em papel gráfico. Químicos altamente treinados estudaram os padrões de picos para identificar cada composto. Nos anos 70, foram adicionados conversores analógico-digitais aos espectrômetros de massa. Isto permitiu que os computadores armazenassem e interpretassem os resultados. À medida que os computadores cresciam mais rápido e menor, o GC-MS tornou-se mais rápido e se espalhou dos laboratórios para o dia-a-dia. Hoje, os instrumentos computadorizados de GC-MS são amplamente utilizados no monitoramento ambiental da água, ar e solo. Também é usado na regulamentação da agricultura, segurança alimentar e na descoberta e produção de medicamentos.

O desenvolvimento de pequenos computadores contribuiu para a simplificação das máquinas GC-MS. Também reduziu muito o tempo necessário para analisar uma amostra. Electronic Associates, Inc. (EAI) era um dos principais fornecedores americanos de computadores analógicos. Em 1964, a EAI iniciou o desenvolvimento de um espectrômetro de massa controlado por computador sob a direção de Robert E. Finnigan. Em 1966, mais de 500 instrumentos de analisadores de gás foram vendidos. Em 1967, foi formada a Finnigan Instrument Corporation (FIC). No início de 1968, entregou o primeiro protótipo de instrumentos quadrapole GC-MS para a Universidade de Stanford e Purdue. A FIC acabou sendo renomeada Finnigan Corporation e passou a se estabelecer como líder mundial em sistemas GC-MS.

Operação básica

O GC-MS pode encontrar todos os compostos misturados em um objeto de amostra. O operador dissolve a amostra em um líquido. O operador então injeta o líquido em um fluxo de gás. (Hélio, hidrogênio ou gás nitrogênio são usados com mais freqüência). O gás flui através de um tubo com um revestimento especial. Como cada composto da amostra gruda no revestimento de uma maneira diferente, cada composto sai do tubo em um momento diferente. Portanto, o revestimento é usado para separar cada composto que foi misturado na amostra. Como cada composto sai na extremidade do tubo, ele é ionizado e recebe uma carga elétrica. A maioria dos compostos se rompe quando eles são ionizados. As diferentes peças voam sob um ímã que separa as peças com base em seu peso e carga. Um computador mede então todas as peças de cada composto. Comparando as medidas com uma biblioteca computadorizada de compostos conhecidos, o computador faz uma lista com os nomes de todos os compostos da amostra. O computador também pode dizer quanto de cada composto estava na amostra.

Instrumentação

O GC-MS é composto por dois grandes blocos de construção: o cromatógrafo de gás e o espectrômetro de massa. O cromatógrafo de gás utiliza uma coluna capilar que depende das dimensões da coluna (comprimento, diâmetro, espessura do filme), bem como das propriedades de fase (por exemplo, 5% de fenil polisiloxano). A diferença nas propriedades químicas entre diferentes moléculas de uma mistura separará as moléculas à medida que a amostra percorrer o comprimento da coluna. As moléculas levam diferentes quantidades de tempo (chamado tempo de retenção) para sair do (eluir do) cromatógrafo de gás. Isto permite que o espectrômetro de massa a jusante capture, ionize, acelere, defleta e detecte as moléculas ionizadas separadamente. O espectrômetro de massa faz isto quebrando cada molécula em fragmentos ionizados e detectando estes fragmentos usando sua relação de massa para carregar.

Estas duas máquinas, utilizadas em conjunto, permitem uma precisão de identificação de substâncias muito mais fina do que qualquer uma das unidades utilizadas separadamente. Não é possível fazer uma identificação precisa de uma determinada molécula apenas por cromatografia de gás ou espectrometria de massa. O processo de espectrometria de massa normalmente requer uma amostra muito pura. No passado, a cromatografia de gás usava outros detectores, como um detector de ionização de chama. Estes detectores não podem separar diferentes moléculas que levam o mesmo tempo para percorrer a coluna. (Quando duas moléculas diferentes têm o mesmo tempo de retenção, diz-se que elas "co-elutam"). As moléculas co-elutantes confundirão os programas de computador que estão lendo um único espectro de massa para ambas as moléculas.

Às vezes, duas moléculas diferentes também podem ter um padrão semelhante de fragmentos ionizados em um espectrômetro de massa (espectro de massa). A combinação dos dois processos reduz a possibilidade de erro. É extremamente improvável que duas moléculas diferentes se comportem da mesma maneira tanto em um cromatógrafo de gás quanto em um espectrômetro de massa. Portanto, se um espectro de massa corresponder ao analito de interesse, o tempo de retenção desse espectro pode ser verificado em relação a um tempo de retenção de GC característico para aumentar a confiança de que o analito está na amostra.

Tipos de detectores de espectrômetros de massa

O tipo mais comum de EM associado a um GC é o espectrômetro de massa quadripolar. A Hewlett-Packard (agora Agilent) o comercializa sob o nome comercial "Detector Seletivo de Massa" (MSD). Outro detector relativamente comum é o espectrômetro de massa de armadilha de íons. Além disso, pode-se encontrar um espectrômetro de massa magnético do setor. Entretanto, estes instrumentos particulares são caros e volumosos e não são tipicamente encontrados em laboratórios de serviço de alto rendimento. Outros detectores são usados como o tempo de vôo (TOF), quadruplos tandem (MS-MS) (veja abaixo), ou no caso de um capturador de íons MSn. O n indica o número de estágios de espectrometria de massa.

O interior do GC-MS, com a coluna do cromatógrafo de gás no forno à direita.


Esquema de GC-MS

Análise

Um espectrômetro de massa é tipicamente usado de duas maneiras: Varredura completa ou monitoramento seletivo de íons (SIM). O GC-MS típico pode funcionar de qualquer maneira sozinho, ou ambos ao mesmo tempo.

MS de varredura completa

Ao coletar dados no modo de varredura completa, uma faixa alvo de fragmentos de massa é selecionada e colocada no método do instrumento. Um exemplo de uma faixa ampla típica de fragmentos de massa a serem monitorados seria m/z 50 a m/z 400. A determinação da faixa a ser usada é em grande parte definida pelo que se espera que esteja na amostra enquanto se está ciente do solvente e de outras possíveis interferências. Se um EM procura fragmentos de massa com um m/z muito baixo, ele pode detectar ar ou outros possíveis fatores interferentes. O uso de uma grande faixa de varredura diminui a sensibilidade do instrumento. A máquina realizará menos varreduras por segundo porque cada varredura levará mais tempo para detectar uma gama mais ampla de fragmentos de massa.

A varredura completa é útil para determinar compostos desconhecidos em uma amostra. Ela fornece mais informações do que o SIM quando se trata de confirmar ou resolver compostos em uma amostra. A maioria dos instrumentos é controlada por um computador que opera um programa de computador chamado "método do instrumento". O método de instrumento controla a temperatura no GC, a taxa de varredura MS e a gama de tamanhos de fragmentos sendo detectados. Quando um químico está desenvolvendo um método de instrumento, o químico envia soluções de teste através do GS-MS em modo de varredura completa. Isto verifica o tempo de retenção do GC e a impressão digital do fragmento de massa antes de passar para um método de instrumento SIM. Instrumentos GC-MS especializados, tais como detectores de explosivos, têm um método de instrumento pré-carregado na fábrica.

Monitoramento de íons selecionados

No monitoramento de íons selecionados (SIM), o método do instrumento se concentra em certos fragmentos de íons. Somente esses fragmentos de massa são detectados pelo espectrômetro de massa. As vantagens do SIM são que o limite de detecção é menor, uma vez que o instrumento está observando apenas um pequeno número de fragmentos (por exemplo, três fragmentos) durante cada varredura. Mais varreduras podem ser realizadas a cada segundo. Como apenas alguns poucos fragmentos de massa de interesse estão sendo monitorados, as interferências de matriz são tipicamente menores. Para melhorar as chances de ler um resultado positivo corretamente, as proporções de íons dos vários fragmentos de massa são comparáveis a um padrão de referência conhecido.

Tipos de ionização

Depois que as moléculas percorrem o comprimento da coluna, passam pela linha de transferência e entram no espectrômetro de massa, elas são ionizadas por vários métodos. Tipicamente, apenas um método de ionização é utilizado em um determinado momento. Uma vez que a amostra é fragmentada, ela será então detectada, geralmente por um diodo multiplicador de elétrons. O diodo trata o fragmento de massa ionizada como um sinal elétrico que é então detectado.

Os químicos selecionam uma técnica de ionização separadamente da escolha do Full Scan ou do monitoramento SIM.

Ionização por elétrons

O tipo mais comum de ionização é a ionização por elétrons (EI). As moléculas entram na EM (a fonte é um quadrupolar ou a própria armadilha de íons em uma EM de armadilha de íons) onde são atingidas por elétrons livres emitidos por um filamento. Isto é como o filamento que se encontraria em uma lâmpada incandescente padrão. Os elétrons atingem as moléculas, fazendo com que a molécula se fragmente de uma forma característica que pode ser repetida. Esta técnica de "ionização dura" resulta na criação de mais fragmentos de baixa relação massa/carga (m/z). EI tem poucos, ou nenhum, fragmento com uma massa próxima à massa da molécula original. Os químicos consideram que a ionização dura está disparando elétrons para as moléculas da amostra. Em contraste, "ionização suave" é colocar uma carga sobre a molécula da amostra, atingindo-a com um gás introduzido. O padrão de fragmentação molecular depende da energia eletrônica aplicada ao sistema, tipicamente 70 eV (Volts de elétrons). O uso de 70 eV ajuda a comparar os espectros gerados da amostra de teste com os espectros conhecidos da biblioteca. (Os espectros da biblioteca podem vir de softwares fornecidos pelo fabricante ou desenvolvidos pelo National Institute of Standards (NIST-USA)). O software pesquisa os espectros da biblioteca usando um algoritmo de correspondência, como o Probability Based Matching ou a correspondência de pontos-produtos. Muitas agências de padronização de métodos agora controlam estes algoritmos e métodos para garantir sua objetividade.

ionização química

Na ionização química (CI), um gás reagente, tipicamente metano ou amônia, é colocado no espectrômetro de massa. Existem dois tipos de IC: IC positivo ou IC negativo. De qualquer forma, o gás reagente irá interagir com os elétrons e o analito e causar uma ionização "suave" da molécula de interesse. Uma ionização mais suave fragmenta a molécula a um grau menor do que a ionização dura do EI. Os químicos preferem o CI ao invés do EI. Isto porque o CI produz pelo menos um fragmento de massa com um peso, que é quase o mesmo que o peso molecular do analito de interesse.

Ionização Química Positiva

Na ionização química positiva (PCI), o gás reagente interage com a molécula alvo, na maioria das vezes com uma troca de prótons. Isto produz a espécie de íon em quantidades relativamente altas.

Ionização Química Negativa

Na ionização química negativa (NCI), o gás reagente diminui o impacto dos elétrons livres sobre o analito alvo. Esta diminuição de energia normalmente deixa o fragmento em grande quantidade. (Os fragmentos não se rompem mais).

Interpretação

O objetivo principal da análise de instrumentos é medir uma quantidade de substância. Isto é feito comparando as concentrações relativas entre as massas atômicas no espectro de massa gerada. Dois tipos de análise são possíveis, comparativa e original. A análise comparativa compara essencialmente o espectro dado a uma biblioteca de espectro para ver se suas características estão presentes para alguma amostra conhecida na biblioteca. Isto é melhor realizado por um computador porque há muitas distorções visuais que podem ocorrer devido a variações na escala. Os computadores também podem correlacionar mais dados (como os tempos de retenção identificados pela GC), para relacionar com mais precisão certos dados.

Outro método de análise mede os picos em relação uns aos outros. Neste método, o pico mais alto é fixado em 100%. Os outros picos dão um valor igual à relação entre a altura do pico mais alto e a altura do pico mais alto. Todos os valores acima de 3% são atribuídos. A massa total do composto desconhecido é normalmente indicada pelo pico pai. O valor deste pico pai pode ser usado para caber com uma fórmula química contendo os vários elementos que se acredita estarem no composto. O padrão isotópico no espectro é único para elementos que possuem muitos isótopos. Portanto, ele também pode ser usado para identificar os vários elementos presentes. Isto informa a fórmula química geral da molécula desconhecida. Como a estrutura e as ligações de uma molécula se separam de maneiras características, elas podem ser identificadas a partir da diferença nas massas dos picos. A estrutura da molécula identificada deve ser consistente com as características registradas pelo GC-MS. Tipicamente, esta identificação é feita automaticamente por programas de computador que vêm com o instrumento. Esses programas combinam os espectros com uma biblioteca de compostos conhecidos que possuem a mesma lista de elementos que poderiam estar presentes na amostra.

Uma análise de "espectro completo" considera todos os "picos" dentro de um espectro. Mas, o monitoramento seletivo de íons (SIM) monitora apenas os picos selecionados associados a uma substância específica. Os químicos assumem que em um determinado tempo de retenção, um conjunto de íons é característico de um determinado composto. O SIM é uma análise rápida e eficiente. O SIM funciona melhor quando o analista tem informações prévias sobre uma amostra ou está procurando apenas algumas substâncias específicas. Quando a quantidade de informações coletadas sobre os íons em um determinado pico cromatográfico de gás diminui, a sensibilidade da análise aumenta. Assim, a análise SIM permite que uma quantidade menor de um composto seja detectada e medida. Mas o grau de certeza sobre a identidade desse composto é reduzido.

GC-tandem MS

Quando uma segunda fase de fragmentação de massa é adicionada, por exemplo, usando um segundo quadrupole em um instrumento quadrupolar, ele é chamado de MS tandem (MS/MS). MS/MS são bons em medir baixos níveis de compostos-alvo em uma amostra com uma matriz de compostos de fundo que não são de interesse.

O primeiro quadrupole (Q1) está conectado com uma célula de colisão (Q2) e outro quadrupole (Q3). Ambos os quadrupolares podem ser usados em modo de varredura ou estático, dependendo do tipo de análise MS/MS utilizada. Os tipos de análise incluem varredura de íons do produto, varredura de íons precursores, Monitoramento de Reação Selecionada (SRM) e Varredura de Perda Neutra. Por exemplo: Quando Q1 está em modo estático (olhando apenas uma massa como no SIM), e Q3 está em modo de varredura, obtém-se o chamado espectro de íons de produto (também chamado de "espectro filha"). Deste espectro, pode-se selecionar um íon de produto proeminente que pode ser o íon do produto para o íon precursor escolhido. O par é chamado de "transição" e forma a base para o SRM. O SRM é altamente específico e elimina quase completamente o fundo da matriz.

Aplicações

Monitoramento e limpeza ambiental

Muitos químicos acreditam que o GC-MS é a melhor ferramenta para monitorar os poluentes orgânicos no meio ambiente. O custo do equipamento GC-MS tem diminuído muito. A confiabilidade do GC-MS tem aumentado ao mesmo tempo. Ambas as melhorias têm aumentado o uso em estudos ambientais. Alguns compostos, tais como certos pesticidas e herbicidas, não podem ser identificados pelo GC-MS. Eles são muito similares a outros compostos relacionados. Mas para a maioria das análises orgânicas de amostras ambientais, incluindo muitas das principais classes de pesticidas, o GC-MS é muito sensível e eficaz.

Investigação forense criminal

O GC-MS pode analisar as partículas de um corpo humano a fim de ajudar a ligar um criminoso a um crime. A lei aceita o uso do GC-MS para analisar os detritos de fogo. De fato, a Sociedade Americana para Teste de Materiais (ASTM) tem um padrão para análise de detritos de fogo. A GCMS/MS é especialmente útil aqui, pois as amostras freqüentemente contêm matrizes muito complexas e os resultados, usados em tribunal, precisam ser altamente precisos.

Aplicação da lei

O GC-MS é usado para detecção de narcóticos ilegais, e pode eventualmente substituir os cães farejadores de drogas. Também é comumente usado em toxicologia forense. Ele ajuda a encontrar drogas e/ou venenos em espécimes biológicos retirados de suspeitos, vítimas ou um cadáver.

Segurança

Após os ataques terroristas de 11 de setembro de 2001, os sistemas de detecção de explosivos passaram a fazer parte de todos os aeroportos dos EUA. Estes sistemas funcionam com uma série de tecnologias, muitas delas baseadas no GC-MS. Existem apenas três fabricantes certificados pela FAA para fornecer esses sistemas. O primeiro é o Thermo Detection (anteriormente Thermedics), que produz o EGIS, uma linha de detectores de explosivos baseada no GC-MS. O segundo é a Barringer Technologies, que agora é propriedade da Smith's Detection Systems. A terceira é a Ion Track Instruments (parte da General Electric Infrastructure Security Systems).

Análise de alimentos, bebidas e perfumes

Alimentos e bebidas contêm muitos compostos aromáticos, alguns naturalmente presentes nas matérias primas e outros que se formam durante o processamento. O GC-MS é amplamente utilizado para a análise destes compostos que incluem ésteres, ácidos graxos, álcoois, aldeídos, terpenos, etc. Também é usado para detectar e medir contaminantes de deterioração ou adulteração que podem ser prejudiciais. Os contaminantes são freqüentemente controlados por agências governamentais, por exemplo, pesticidas.

Astroquímica

Vários GC-MS deixaram a terra. Dois foram para Marte no programa Viking. Venera 11 e 12 e a Pioneer Venus analisou a atmosfera de Vênus com o GC-MS. A sonda Huygens da missão Cassini-Huygens aterrissou um GC-MS na maior lua de Saturno, Titan. O material no cometa 67P/Churyumov-Gerasimenko será analisado pela missão Rosetta com um GC-MS chiral em 2014.

Medicina

Os GC-MS são usados em testes de triagem de recém-nascidos. Estes testes podem encontrar dezenas de doenças metabólicas congênitas (também conhecidas como Inborn error of metabolism). O GC-MS pode determinar compostos na urina, mesmo em quantidades muito pequenas. Esses compostos normalmente não estão presentes, mas aparecem em indivíduos que sofrem de distúrbios metabólicos. Isto está se tornando uma maneira comum de diagnosticar o IEM para diagnóstico precoce e início do tratamento. Isto eventualmente leva a um resultado melhor. Agora é possível testar um recém-nascido para mais de 100 distúrbios metabólicos genéticos através de um teste de urina ao nascimento baseado em GC-MS.

Em combinação com a rotulagem isotópica de compostos metabólicos, o GC-MS é usado para determinar a atividade metabólica. A maioria das aplicações se baseia no uso de ^13C como etiquetagem e na medição da razão ^13C-12C com um espectrômetro de massa de razão isotópica (IRMS). Um IRMS é um espectrômetro de massa com um detector projetado para medir alguns íons selecionados e valores de retorno como proporções.